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    TOPO Cloning Kit

    ——2017-11-09

    TOPO Cloning Kit

     

    GT1505-20T  GV TOPO-TA-Amp Cloning Kit适用于Taq DNA聚合酶扩增的末端加“A”的PCR片段的快速克隆

    GT1503-20T  GV TOPO-Blunt-Amp Cloning Kit适用于PfuKOD等高保真聚合酶扩增的平末端的PCR片段的快速克隆

    产品规格:20T

    保存与运输:-20℃。

     

    一、产品特点

    1、连接只需5 min

    2、载体不含LacZ基因,无需蓝白斑筛选。

    3、优质PCR产物(无非特异性条带、无引物二聚体)可直接进行克隆,无需纯化。

     

    二、PCR产物的制备:

    1、扩增引物不能磷酸化。

    2PCR反应结束后,电泳检测PCR产物产量和质量,若有非特异性扩增或引物二聚体,则需切胶回收目的条带后进行克隆。

     

    三、操作步骤

    克隆反应:

    1、室温下,按下表配制反应体系:

    试剂

    添加量

    DNA片段

    0.5-8 μl

    TOPO cloning vector

    1 μl

    10×TOPO Buffer

    1 μl

    ddH2O

    x μl

       连接反应体系的总体积为10μl(用ddH2O补足)。轻弹离心管将反应体系混匀,短暂离心3-5s

       注:整个操作过程均在室温条件下进行,切勿在冰上操作。

       如果PCR产物电泳检测仅有很亮的目的条带,无非特异性条带和引物二聚体,可取0.5-1μlPCR产物原液直接进行克隆

    2、将离心管于室温(22-30℃)下静置0-5 min(不可超过5 min)。反应结束后将离心管放置在冰上,进行后续的转化操作。

             注:室温下(22-30℃)反应时间不可超过5 min,时间过长克隆效率会下降。若室温较 低,建议使用PCR仪控温,可设置25℃反应5min。若连接产物未能立即用于转化,需保存于-20℃。不建议对连接产物做长期保存。

    3、阳性对照实验:

    1μl试剂盒提供的对照片段进行克隆、转化后,将菌液涂布在含有相应抗生素的培养平板上,37℃培养过夜。取菌斑进行PCR扩增。

    附:不同长度的DNA片段的最适添加量参照表:

    DNA片段大小(bp

    最适添加量(ng

    100-1000

    20-50

    1000-2000

    50-100

    2000-5000

    100-200

    转化(此操作需在无菌条件下进行):

     

    1、取5 μl连接产物加入到50-100 μl 刚刚融化的感受态细胞中(感受态细胞应刚从-80℃取出,于冰上融化,刚刚融化便加入连接产物),温和混匀,冰浴2-30 min

    242℃水浴热激30s。(勿晃动离心管)

    3、立即转移到冰上,静置2 min(冰浴期间勿晃动离心管)。

    4、加入300-500 μl LB培养基(不含抗生素),37℃,200-250 rpm振荡培养60 min

    注:当插入片段的长度<2 kb时,可省略复苏步骤(步骤4),直接将转化后的菌液涂布在含氨苄青霉素的平板上,37℃培养过夜。

    5、取200 ul菌液,涂布于含氨苄青霉素的平板上37℃培养过夜。

    注:若想获得更多克隆,可将菌液低速(3000 g)离心2 min,弃掉部分上清液,用移液器吹打至菌体完全重悬,吸取全部菌液涂布于含氨苄青霉素的平板上,37℃培养过夜。

     

    检测:

    1、菌落PCR法(无菌操作):

    1)挑选单菌落至10 μl无菌水中,充分混匀。

    2)取2 μl菌液作为PCR反应的模板,用试剂盒提供的M13F/M13R引物扩增插入片段。

    3PCR反应条件

         94  2 min

         94  30 sec

         56  30 sec    30 cycles

         72  1 kb/min  (根据片段大小确定延伸时间)

         72  10 min

    4)电泳检测PCR产物,若载体自连,则扩增出的片段大小为143 bp

    5)确定重组子后将剩余的8 μl菌液转接到LB培养基中(含相应的抗生素),摇菌培养过夜,然后提取质粒进行测序。

    2、限制性酶切法:

    1)挑取单克隆至LB培养基中(含相应抗生素),过夜摇菌,抽提质粒。

    2)用EcoRI/EcoRV/PstI或合适的限制性内切酶,对质粒进行酶切,鉴定重组子。

     

    测序:

        用M13FM13R通用引物测序,然后进行序列分析。

           M13F5-TGTAAAACGACGGCCAGT-3

           M13R5-CAGGAAACAGCTATGACC-3

     

    四、常见问题分析:

    重组子克隆菌少,或阳性率低:

    1、感受态效率低:使用转化效率>5×107fcu/μg的感受态细胞;

    2、连接反应在低温下(如碎冰上)操作:应在室温下操作;

    3、连接反应时间过长:室温下放置5min即可,时间过长效率会下降;

    4PCR产物加入量太少或太多:按照推荐量加入;

    5PCR产物纯度低:重新扩增或重新纯化PCR产物;

    6PCR产物质量低,切胶十紫外照射时间长:使用蓝光切胶仪切胶或加快切胶速度,减少PCR产物在紫外下暴露的时间;

    7、转化后没有做复苏:可加入LB培养基(无抗生素)震荡培养60min

    8、克隆基因可能对宿主菌有毒性,比如某些编码膜蛋白和DNA结合蛋白的基因,某些启动子和调节序列基因,或含有倒置或串联重复序列的基因:选用室温过夜培养平板。

     

    附:载体图谱


     


     

     

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